微生物冻干机预冻过程一方面要保护微生物的主要性能不变，另一方面要获得冻结后微生物有合理的结构，以利于水分的升华。微生物冻干机预冻过程注意因素主要由3个方面决定：预冻速率、预冻温度下限、预冻时间。冻干瓶装厚度不超过10 mm。样品的固体含量一般为2-10%，如低于2%，冻干样品的机械性能就可能不稳定，而高于10%则冻干不易成功，且复水也比较困难。
(1) 预冻速率是影响微生物存活率的重要因素，由于微生物细胞对水分的渗透率不同，导致不同微生物较佳预冻速率不同。快速冻结，胞内的水分来不及通过细胞膜渗出，胞内溶液过冷而结冰，细胞的体积膨大，末尾导致细胞破裂；慢速冻结，胞外溶液中水分大量结冰，溶液的浓度提高，胞内的水分便大量向外渗透，导致细胞的剧烈收缩，造成细胞损伤。实验证明，快速冻结导致升华速率低，解吸速率快，慢速冻结反之。实际上一般冻干微生物样品的预冻速率介于快冻与慢冻之间。就细菌而言，通常采用分段降温速率，从室温快速降到约4℃，然后每分钟降低1℃，至-40℃后，末尾按每分钟3-5℃的速率降至-70℃左右。
(2) 预冻温度下限一般应低于溶液共晶点温度，即在共晶点温度以下8-10℃。共晶点与微生物类群、保护剂的种类和浓度有关。
(3) 适宜的预冻时间是指一次干燥之前所有的微生物样品均已冻实所需要的时间，以免因抽真空而引起喷瓶。若预冻时微生物样品冻结不实，冻干后微生物样品表面凹凸不平。一般要求冻干瓶装厚度不超过10 mm。微生物样品的固体含量一般为2%-10%，如低于2%，冻干微生物样品结构的机械性能就可能不稳定，而高于10%则冻干不易成功，且复水也比较困难。
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