真空冷冻干燥机
由于真空冷冻干燥机具有其它干燥方法无可比拟的优点,因此真空冷冻干燥机一直以来越来越受到人们的青睐,在医药、生物制品和食品、化工方面的应用已日益广泛。
利用真空冷冻干燥机从猪血中提取抗菌肽,属于天然提取物,具有天然、无毒、无污染、无残留、无副作用、高效抗菌等特点,是一种新型的绿色抗微生物药物。
利用真空冷冻干燥机从猪血中提取抗菌肽,它包括以下具体步骤:
(1)猪血采集:从屠宰场采取新鲜猪血2-3L,使用5%柠檬酸钠抗凝;
(2)萃取溶液:将新鲜猪血放置37℃温箱静置L_2h取上清,按照1:4的比例加入0.84%氯化铵溶液,混匀静置3min,常温400r/Min,离心10min,弃上清按比例加入氯化铵溶液混匀静置3min,再次500r/Min离心10min ;弃上清,使沉淀与少量冷的生理盐水,即4℃的生理盐水短时间混合,再用200ml冷的10%冰醋酸,即4℃的10%冰醋酸使沉淀悬浮,充分混匀,倒入50ml烧杯,超声波处理50次,然后溶液使用磁力搅拌器混匀搅动于4℃下萃取一夜;次日,将萃取的溶液取出15000r/Min离心30min,取上清4℃下保存,沉淀再次混悬于冷的10%醋酸中,充分混匀,混匀搅动于4℃下萃取一夜;第三天将萃取的溶液取出15000r/Min离心30min,最后将溶液4℃下保存;
(3)溶液除酸、浓缩、冻干:合并所保存的溶液,将溶液注入透析袋,扎紧袋口,然后将其放入烧杯,再向烧杯中倒入蒸馏水,蒸馏水液面要超过透析袋,4℃下透析除酸,每12h换水一次,直至透析袋外蒸馏水PH大于6,将透析袋放入瓷盘中,撒上聚乙二醇6000,透析浓缩约3-4h后即可将透析袋取出,将浓缩的溶液取出,放进真空冷冻干燥机内真空低温冻干,转移至青霉素小瓶中,密封-20℃保存;
(4)抗菌肽的分离:将冻干样品用0.5%甲醇溶解,再上样于层析柱葡聚糖凝胶SephadexG25,同时打开柱的下端出口,注意控制流速为LmL/Min,5mL/管;用部分收集器收集洗脱液,5mL/管,收集的溶液用紫外分光光度计测其在280nm处的吸收值,将在280nm处有吸收的溶液分装于青霉素瓶中,再在真空冷冻干燥机中低温冻干,-80℃保存;取各瓶冻干保存的样品各20mg,分别溶于灭菌双蒸水中,无菌条件下用微孔滤膜过滤样品,将药敏纸片浸泡于过滤后的样品中,浸泡过夜后,用平皿纸片法初筛,收集具有抗菌活性的组分,置于5℃保存;
(5)抗菌肽的纯化与浓缩:使用超滤装置进行超滤,膜包选用截流分子量为20kD。洗脱液选用0.5%甲醇溶液,滤出液既为所要获得的溶液。
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