蒸汽消毒型冻干机采用在位灭菌装置SIP(121oC蒸汽灭菌,双氧水灭菌装置)，从根本上避免了无菌室的二次污染问题。可消毒的波纹管套有效地防止了液压油的污染。使用蒸汽消毒的冻干机本身相当于一台高压消毒柜，冻干箱和水汽凝结器均使用蒸汽消毒，因此它们必须不仅能耐受负压，而且要耐受正压，二者均装有安全放气阀，为了消毒后冷却系统，大型冻干机的冻干箱和水汽凝结器均设计成双层夹套式结构，以便用冷却水进行冷却，大型冻干机的箱门也是双层夹套式结构。冻干机的箱门需适合耐正压，因此普遍采用像高压消毒柜那样的辐射杆式锁紧装置，并装有安全设备，当冻干箱内处于正压和高温时，冻干箱门无法打开。
为了提高消毒效果和缩短消毒时间，消毒方式均为预真空式，因此冻干机带有一台水环式真空泵，除抽空系统之外，还用于消毒结束后抽除水分，作为系统的干燥之用。
为了适应蒸汽消毒的高温（最高达138℃），冻干箱板层内的传温流体需采用耐高温型流体。现在大都采用硅油；也有采用三氯乙烯的，但需用氮气加压，以提高沸点。真空测量头也要求采用耐高温高压型的探头。最好使用电容式真空仪表。对于带有箱内压塞装置的冻干机，为了达到严格消毒的目的，在液压活塞杆上应加上一个不锈钢的波纹管套管。
现代冻干机的蒸汽消毒可以预先编制程序，全自动地进行操作。蒸汽消毒大致有如下步骤：
1． 关闭冻干箱和水汽凝结器与外界相通的阀门，关闭真空泵和水汽凝结之间的阀门。
2． 用水环式真空泵抽空系统，锁紧箱门。
3． 放入蒸汽进行升温，抽空系统，重复三次。
4． 在规定的温度进行保温或保压。
5． 冷却干燥阶段，用水环式真空泵进行抽空，并用冷冻机降温。
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